基因編輯技術在水產生物中的研究應用

    基因編輯是指對基因組進行定點修飾的一項基因工程技術，其通過對目標基因進行刪除、替換、插入等操作，以獲得新的功能或表型?；蚓庉嫾夹g已應用于生命科學多個領域，在動物疾病模型研究、植物遺傳改良、遺傳性疾病以及非遺傳性疾病的治療中顯示出較高的應用價值，不斷拓展對生物體遺傳改造的深度和廣度，為科學發展提供了新的研究與應用方案。目前水產生物基因編輯技術主要有轉錄水平中的轉錄后調控技術RNA干擾和核酸水平人工核酸酶技術。其中主要的人工核酸酶技術有鋅指核酸酶技術，類轉錄激活因子效應物核酸酶技術和成簇規律性間隔的短回文序列重復技術。

一、RNA干擾（RNAi）技術

RNAi是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。RNAi作用機制分為起始階段和效應階段。起始階段：外源或內源的dsRNA 進入細胞后, 被Dicer酶劈成21-23個堿基的小片段,效應階段：siRNA和RNA 誘導沉默復合物相結合, 結合后的復合物具有核酸酶的作用，能識別并降解目標RNA。RNAi在水產生物中的應用目前主要是在方法構建、抗病毒機制、調節生長發育、基因表達調控和基因功能研究等方面。

二、人工核酸酶技術

使用RNAi 技術雖然可以在短時間導致靶基因表達量降低，用以研究靶基因的功能，但該技術無法獲得穩定遺傳突變體。因此這些研究基因功能技術受到各自技術瓶頸制約，使得水產生物基因的研究大都停留在基因克隆和表達分析等方面，基因功能方面研究進展緩慢，人工核酸酶技術的出現為高效、低成本、高穩定性突變體構建及實現基因功能研究帶來巨大的技術突破，極大促進了水產生物基因功能研究。人工核酸酶是一類人工構建的能識別特定 DNA 序列并能在 DNA 分子上形成雙鏈切割的核酸酶。其工作機制是受損的 DNA 通過兩種修復機制,即同源重組和非同源末端連接進行修復。人工核酸酶技術目前形成 3 種代表性的技術，即鋅指核酸酶技術(ZFNs)、類轉錄激活因子效應物核酸酶技術(TALEN)和 成簇規律性間隔的短回文序列重復(CRISPR/Cas9）技術。

鋅指核酸酶又名鋅指蛋白核酸酶，不是自然存在的，而是一種人工改造的核酸內切酶由一個 DNA 識別域和一個非特異性核酸內切酶構成，其中 DNA 識別域賦予特異性，在 DNA 特定位點結合，而非特異性核酸內切酶賦剪切功能，兩者結合就可在DNA 特定位點進行定點斷裂。鋅指核酸酶在水產領域的應用主要是方法建立，基因功能分析。2011年王雯雯等在利用鋅指蛋白酶構建了斑馬魚基因敲除的實驗體系，鋅指核酸酶技術研究開始在國內起步。但是由于鋅指核酸酶由技術由于于操作難度、復雜性及價格原因未能得到大規模應用，隨著第二代核酸酶技術的出現，其逐步被第二代核酸酶技術所取代。

TALEN 技術是屬于第二代人工核酶技術，是二聚的轉錄因子/核酸酶，由33 至35個氨基酸模塊構成，包含核定位信號的N端結構域、識別特定DNA序列的典型串聯TALE重復序列的中央結構域和具有FokI核酸內切酶功能的C端結構域。其中每模塊靶定特定核苷酸序列。通過組裝這些模塊，研究人員可靶定他們想要的任何序列。其特點是在同一蛋白（TALEN）上，實現有序實現引導細胞進入細胞核、靶位點DNA的特異性識別和靶位點DNA的切割三個不同功能。

CRISPR/Cas9是在細胞系中進行基因敲除的新方法，該方法利用改造自細菌的Ⅱ型 CRISPR系統，是繼ZFNs和TALEN等技術后可用于定點構建基因敲除大、小鼠動物的第三種人工核酶技術，被稱為第三代人工核酸酶。中國學者黃軍首次利用CRISPR/Cas9開展人類胚胎基因編輯研究，引發學界對編輯技術的倫理思考。標志基因編輯技術實現了從模式生物到智能生物的全覆蓋，也標志著基因功能研究全面進入基因編輯的新時代。CRISPR/Cas9 技術在水產生物中的應用主要是在編輯方法建立研究方面，以斑馬魚為研究對象開展了方法優化、細胞系驗證、多種基因和多種方法的嘗試均獲得基因編輯的良好效果。同時CRISPR/Cas9 技術在玻璃海鞘、海膽、?？?、大西洋角螺、端足類動物、脊尾白蝦、三角褐指藻、海七鰓鰻、大西洋鮭、青鳉[等十余種水產生物中均取得了成功，涵蓋了尾索動物、棘皮動物、刺胞動物、貝類、魚類、甲殼動物和藻類等 8 個生物類群。

三、基因編輯技術在水產生物領域應用的展望

水產生物技術起步較晚，目前缺乏成熟有效的基因編輯技術已成為制約開展基因功能研究的重要因素，基因組編輯技術的操作對象是基因組DNA,且主要是通過顯微注射對細胞系或胚胎進行操作。而目前為止，水產生物細胞系較少，特別是甲殼類動物還未形成成熟的細胞系構建技術體系,且卵殼較硬易碎。顯微注射技術及去核操作難度大，成功率低，成為制約水產生物基因編輯技術應用的主要瓶頸。水產生物基因編輯技術主要研究各類編輯方法在不同類型水產生物方法建立，基因結構變化檢測，功能基因初步分析，完善的基因編輯方法與其他模式生物相比仍存在較大差異，還需在基因編輯技術專有設備，技術手段，編輯基因類型等方面根據水產生物胚胎特點不斷發展和完善，同時利用人工智能技術手段逐步提高人工智能領域在顯微注射及儀器實驗精度的提高，減少對胚胎的影響，提高轉基因成功率及胚胎孵化效率。

通過基因編輯技術有望實現更好的利用基因組信息和已發掘的遺傳資源，更加快速有效的獲得高產、單性及抗病抗逆新品種，如果在水產領域應用推廣此項技術，敲除魚、蝦、貝類的肌肉抑制基因,增加抗病抗逆基因獲取更高肌肉含量且具有更強適應性的的水產新品種將具有巨大的市場前景和良好的社會和經濟效益，從而更好的為人們提供營養豐富水產品?；蚓庉嫾夹g在水產中的應用已成為一種趨勢，一定會在未來的水產生物技術研究中發揮越來越大的作用。

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                研發中心：鄭巖